Kandel, Schwartz, Jessel (2000)

14: Transmitter Release

TRANSMİTTER SALINMASI

Şakire Pöğün

Beynin öğrenme ve bellek gibi en karmaşık ve üst düzey fonksiyonlarının temelinde aksiyon potansiyelleri ile presinaptik sonlanmalardan transmitter salınması ve kimyasal ileti yer alır. Bu bölümde presinaptik hücre sonlanmasındaki elektriksel olayların nörotransmitter salınması ile bağlantılandırılması irdelenecek.

TRANSMİTTER SALINMASI PRESİNAPTİK SONLANMANIN DEPOLARİZASYONU İLE DÜZENLENİR

Bernard Katz, Ricardo Miledi

Mürekkep balığı dev (pre- ve post- sinaptik bölümlere ayrı elektrodlar yerleştirilebiliyor) sinapsında, presinaptik hücreyi uyarıp postsinaptik hücrede sinaptik potansiyeli kaydettiler.

Presinaptik hücrede: ~110mV amplitüdlü AP (voltaj kapılı kanallardan içe Na⁺ girişi, dışa K⁺ çıkışı) à transmitter salınması à postsinaptik hücrede büyük bir sinaptik potansiyel

Tetrodotoksin ile voltaj kapılı Na⁺ kanalları bloke edilince presinaptik ardarda gelen APlerinin ve dolayısıyla postsinaptik potansiyellerin amplitüdü küçülüyor. Presinaptik potansiye ~40 mV’un altına düşünce sinaptik potasiyel kayboluyor ve transmiter salınması olmuyor. Transmiter salınması (postsinaptik potansiyel ile ölçülüyor) presinaptik depolarizasyona bağımlı!

Fig. 14-1

Membran depolarizasyonu transmitter salınmasına nasıl yol açıyor?

- Na⁺ girişi önemli mi (?)

Katz ve Miledi Na⁺ kanalları bloke durumda iken presinaptik membranı depolarize ettiklerinde (40-70 mV) transmitter salınması oduğunu gösterdiler: Depolarizasyonda her 10 mV artış için transmitter salınmasında 10 kat artış oluyor! à Transmitter salınması Na⁺’dan bağımsız!

- AP ile tetiklenen K⁺ çıkışı neden olabilir mi (?)

- Tetraetilamonyum ile K⁺ kanalları (voltaja duyarlı Na⁺ kanalları ile birlikte) bloke edilip presinaptik sonlanmaya depolarize edici akım uygulandığında, postsinaptik potansiyeller normal genlikte oluyor ve transmitter salınması gerçekleşiyor. Bu deneyde K⁺ çıkışı olmadığı için presinaptik potansiyel de korunuyor.

SONUÇ: Na⁺ ve K⁺ transmitter salınmasında gerekli değil!

Fig. 14-2

TRANSMİTTER SALINMASI Ca⁺⁺ GİRİŞİ İLE TETİKLENİR

Katz ve Miledi dikkatlerini Ca⁺⁺ üzerinde yoğunlaştırıyor. Daha önce José del Castillo ve Katz ekstrasellüler Ca⁺⁺ düzeylerinin transmitter salınması ile doğrudan ilişkili olduğunu göstermişlerdi.

Transmitter salınması intrasellüler bir süreç olduğuna göre, etkili olmak için Ca⁺⁺’un hücre içine girmesi gerek!

Mürekkep balığı dev aksonunda voltaj kapılı Ca⁺⁺ kanalları olduğu biliniyor. Ekstrasellüler Ca⁺⁺ düzeyleri intrasellüler düzeylerin yaklaşık 4 katı- kanallar açılırsa Ca⁺⁺ içe girecek.

Katz ve Miledi, Ca⁺⁺ kanallarının açılmasının iki etkisi olabileceğini, hem AP sırasında Na⁺ gibi depolarizasyona destek sağlayacağını hem de transmitter salınmasında rol oynayan intrasellüler süreçlerde etkili olabileceğini düşündüler.

Presinaptik sonlanmada voltaja duyarlı Ca⁺⁺ kanalları olduğunun kanıtı: Rodolfo Llinas ve ark. à voltaj “clamp” (Na⁺ ve K⁺ kanalları tetrodotoksin ve tetraetilamonyum ile bloke ediliyor) à depolarizasyon ile, kademeli olarak, içe doğru Ca⁺⁺ akımı gösteriliyor.

Fig. 14-3

Ca⁺⁺ kanalları Na⁺ kanallarından farklı olarak, daha uzun süre (presinaptik depolarizasyon boyunca) açık kalıyor.

Tüm sinapslarda transmitter salınmasının önemli bir özelliği: Ca⁺⁺ girişine nonlineer bağımlılık göstermesi: Ca⁺⁺’da 2 kat artış transmitter salınmasında 16 kat artışa yol açıyor. Transmitter salınması için, kalsiyum sensörü denen bir bölgenin 4 Ca⁺⁺ bağlaması gerekiyor.

Akson terminalindeki Ca⁺⁺ akımları, 10-20 kat daha yüksek olan Na⁺ ve K⁺ akımları tarafından gölgeleniyor. Ancak aktif bölgede Ca⁺⁺ girişi sonlanmanın diğer bölümlerinden 10 kat daha fazla. Bu Ca⁺⁺ kanalı olduğu düşünülen intramembranöz partiküllerin dağılımı ile uyumlu.

Fig. 14-7 ve Box 14-2

AP sırasında aktif bölgelerdeki Ca++kanallarından giren Ca++ birkaçyüz msn içinde o bölgedeki konsantrasyonu bin kat arttırıyor (~100 mM). Bu büyük ve hızlı artış, AP ile senkron salınmayı sağlıyor. Kalsiyum sensörü’nün Ca⁺⁺ afinitesi düşük (50-100 mM) oysa enzimatik reaksiyonlarda gereken Ca⁺⁺ 1 mM kadar). Bu düşük afinite nedeniyle etki sadece aktif bölgeye sınırlı ve aynı zamanda etkinin kısa sürmesi sağlanmış oluyor; kanallar kapanınca Ca⁺⁺ düzeyi hemen düşüyor, çünkü 1 ms içinde o bölgedeki lokal Ca⁺⁺ .difüzyonla hemen dağılıyor.

Ca⁺⁺ kanalları Na⁺ kanallarından daha yavaş açıldığı için, Ca⁺⁺ girişi presinaptik hücrede aksiyon potansiyelinin repolarizasyon fazından önce olmuyor. Kimyasal sinaptik iletideki sinaptik gecikmenin nedeni bu! Ancak voltaj kapılı Ca⁺⁺ kanalları salınma bölgesine çok yakın olduğu için, Ca⁺⁺ girdikten 0.2 ms sonra transmiter salınması oluyor.

Fig. 14-4

Aksiyon potansiyelinin süresi giren Ca⁺⁺ ve salınan transmiter miktarını belirliyor.

Tüm hücrelerde Ca⁺⁺ kanalları var. Örneğin bu kanallar iskelet ve kalb kasında eksitasyon-kontraksiyon eşleşmesinde, endokrin bezlerde hormon salgısında rol alıyor.

Ca⁺⁺ kanal tipleri: L, P/Q, N, R, T. Hepsinin biyofiziksel ve farmakolojik özellikleri ve fonksiyonları farklı. Belirleyici olan kanalı oluşturan a1 alt ünitesi. Bu alt üniteyi yapan bir gen ailesi var. Kanalların ayrıca diğer özellikleri belirleyen başka alt üniteleri var: a2, b, g, ve d. Tüm a1 alt üniteler Na⁺ kanallarının a1 alt üniteleri ile homolog.

Fig. 9-14

Nöronların çoğunda birden fazla tipte Ca⁺⁺ kanalı var: Voltaja, farmakolojik ajanlara duyarlılıkları, ve fonksiyonları farklı.

Ca⁺⁺ kanallarındaki farklılığının moleküler temelleri

Gen (a1 için)	Ca^++ kanal tipi	Doku	Seçici blokerler	Fonksiyon
A	P/Q	Nöronlar	w-agatoksin (örümcek zehiri)	Hızlı salınma
B	N	Nöronlar	w-konotoksin (salyangoz zehiri)	Hızlı salınma
C/D/S	L	Nöronlar, endokrin, kalb, iskelet kası	Dihidropiridinler	Yavaş salınma (peptidler)
E	R	Nöronlar	?	Hızlı salınma
G/H	T	Nöronlar, kalb	?	Uyarılabilirlik

L-tipi kanal blokerleri (dihidropiridinler) hipertansiyon tedavisinde kullanılıyor.

L, P/Q, N ve R tipi kanalların aktivasyonu ,için kuvvetli depolarizasyon gerek (-40 veya -20 mV’a getirebilen), bu nedenle bunlara yüksek voltaj ile uyarılabilen kanallar deniyor. T-tipi kanallar daha küçük depolarizasyonlar ile (-60 veya -40 mV’a getirebilen) aktive olabiliyorlar ve bu nedenle istirahat portansiyelindeki küçük sapmalara duyarlılar ve özellikle bazı hücrelerdeki (kalb ve beyin) ritmik “pacemaker” aktivitesinde rolleri var.

Nöronlarda P/Q, N ve R tipi kanallar geleneksel transmitterlerin hızlı salınmasından sorumlu. L tipi kanallar ise nöronlardan nöropeptidlerin, endokrin bezlerden hormonların daha yavaş salınması ile ilgili.

N-tipi kanalların aktif bölgelerde lokalizasyonu floresan işaretli w-konotoksin ile gösterilmiş. L-tipi kanallar ise, daha yavaş etki gösterdikleri için aktif bölgelerde bulunmuyor.

Fig. 14-5

TRANSMİTTERLER “KUANTAL” BİRİMLERLE SALINIRLAR

Transmitterler küçük “paketçikler” halinde salınırlar ve dolayısıyla her paketçik (kuanta) belli bir büyüklükte sinaptik potansiyel oluşturur: Kuantal sinaptik potansiyel. Postsinaptik potansiyel, bu küçük birimlerin toplamıdır. Toplam potansiyelin büyüklüğü, küçük birimlerden çok fazla olduğu için potansiyel düzgün görünür.

Fig. 14-6

Paul Fatt ve Bernard Katz, kurbağa sinir-kas sinapsından kayıt yaparken, presinaptik uyarılma olmaksızın 0.5 mV’luk spontan postsinaptik potansiyeller olduğunu ve bunların aktif bölgeden uzaklaştıkça küçüldüğünü keşfettiler.

Fig. 11-5

Bu bulgu daha sonra memelilerde ve santral sinapslarda da kanıtlandı. Fatt ve Katz’ın bu spontan potansiyellere koyduğu isim: minyatür uç plak potansiyelleri.

Bu potansiyeller, sinir-kas kavşağında fizostigmin ile (AChE inhibitörü) kuvvetleniyor, ACh reseptör blokerleri ile inhibe oluyor. Presinaptik motor nöron dejenerasyonunda kayboluyor, yeni sinaps oluştuğunda ortaya çıkıyor.

Minyatür uç plak potansiyelinin (MUPP) büyüklüğü (~0.5 mV) neden sabit ?

Del Castillo ve Katz:

- Her kuantum bir tek AChR kanalının açılmasına bağlı olabilir mi?

Uç plağa çok az miktarlarda ACh uygulayarak 0.5 mV’dan daha küçük potansiyeller elde ettiler. Demek ki bu potansiyeller birden fazla kanalın açılması ile oluşuyor.

Katz ve Miledi:

Tek bir AChR kanalından geçen akım sadece 0.3 mV kadar. Demek ki tek bir spontan minyatür uç plak potansiyeli ~2000 kanalın açılmasını gerektiriyor. (Bu daha sonra patch-clamp ile deneysel olarak kanıtlandı.)

Box 6-1

Her ACh kanalının açılması için iki a alt üniteye birer ACh bağlanması gerek (toplam 2). Salınan bazı ACh moleküllerinin postsinaptik reseptörlere ulaşamayabileceğini de hesap edersek, bir MUPP için en az 5000 molekül gerek! Bu rakam daha sonra deneysel olarak da kanıtlandı.

- Acaba presinaptik AP ile uyarılma sırasında da kuantal salınma mı oluyor?

- Her AP’in ne kadar kuanta salınmasına yol açacağını ne belirliyor?

- Ca⁺⁺, her kuanta’daki ACh miktarına veya kaç kuanta salınacağına etkili mi?

Del Castillo ve Katz:

Sinir-kas sinapsında, eksternal Ca⁺⁺ düzeyini düşürüyorlar à normalde genliği 70mV olan uç-plak potansiyeli 0.5-2.5 mV’a düşüyor. Ayrıca her uyaranın oluşturduğu yanıt eşit olmuyor ve bazı uyaranlara yanıt alınamıyor (failures). Alınan yanıtlar daima 0.5 mV ve katları.

Fig. 14-6

- AP’e eşlik eden intrasellüler Ca⁺⁺’daki yükselme transmitter salınmasını nasıl etkiliyor?

Eksternal Ca⁺⁺ düzeyinin yükselmesi birim sinaptik potansiyelin genliğini etkilemiyor, ancak yanıt verilememe (failure) sayısı azalıyor ve toplam genlikte artış oluyor. Demek ki Ca⁺⁺ bir kuantadaki transmitter miktarını değil, presinaptik AP’e yanıt olarak kaç kuanta salınacağını belirliyor. Presinaptik sonlanmadaki Ca⁺⁺ düzeyi ne kadar yüksekse, ne kadar fazla Ca⁺⁺ girişi olmuşsa, o kadar fazla sayıda kuanta salınıyor.

Box 14-1: TRANSMİTTER SALINMASININ OLASILIĞININ HESAPLANMASI

Bir “kuanta” transmiter salınması rastgele (random) bir olay. Bir aksiyon potansiyeline yanıt olarak kuantanın salınmasına ilişkin iki olasılık var: salınma veya salınmama (binomial veya Bernoulli denemesi gibi à yazı-tura’ya benziyor). Bir kuantanın aksiyon potansiyeli ile salınması diğer kuantaların ne olacağından bağımsız à Her AP’de salınabilecek kuantaların hesaplanması birçok bağımsız binomial denemeye benziyor (çok sayıda yazı-tura atılması gibi).

Binomial dağılımda:

p = ortalama başarı yüzdesi (belli bir kuantum’un salınma olasılığı)

q veya (1-p) = ortalama başarısızlık

n = salınma olasılığı olan toplam kuanta miktarı

p ve n’nin sabit olduğu kabul edilir! (Her uyarandan sonra depodaki azalma hemen yerine konur.)

p x n = m (kuantal içerik veya kuantal “output” : UPP’ni oluşturacak ortalama kuanta sayısı)

Örnek: Bir terminalde n=5 ve p=0.1 ise, q= 0.9 olacaktır. Bu durumda her AP’de kaç kuanta salınacağı veya kaç başarısız uyarılma olacağı olasılıklarını hesaplayabiliriz.

Mevcut 5 kuantadan hiçbirinin salınmama olasılığı (başarısızlık) her kuantum için olan olasılıkların çarpımıdır:

q⁵ = (0.9)⁵ = 0.59

Demek ki 100 denemede 59 başarısızlık olabilir.

Benzer şekilde 0, 1, 2, 3, 4, 5 kuanta salınma olasılıklarını hesaplayabiliriz:

(q+p)⁵ = q⁵ (başarısızlık) + 5 q⁴p (1 kuantum)

+ 10 q³p² (2 kuanta) + 10 q²p³ (3 kuanta)

+ 5 qp⁴ (4 kuanta) + p⁵ (5 kuanta)

Buna göre, 100 denemede 33 tek, 7 çift, 1 üçlü, 0 dörtlü ve beşli kuanta salınması olasıdır.

m değeri 100-300 (omurgalı sinir-kas kavşağı, mürekkep balığı dev aksonu, Aplisya santral sinapsları) ile 1-4 (omurgalı sempatik gangliyonu ve omurilik) arasında değişir.

p değeri 0.7 (kurbağa sinir-kas kavşağı) veya 0.9 (yengeç sinir-kas kavşağı) kadar yüksek değerlerden bazı santral sinapslarda 0.1’e kadar düşer.

n değerinin ise 1000’den (omurgalı sinir-kas kavşağı) 1’e kadar (santral nöronların tek sonlanmalarında) değişebildiği hesaplanmıştır.

n ve p istatistiksel terimler, temsil ettikleri fiziksel süreçler tam bilinmiyor!

n belki salınabilecek kuanta sayısını değil, presinaptik terminaldeki salınma (aktif) bölgelerini tanımlıyor olabilir. Salınma bölgelerinin sayısı sabit olarak düşünülmekte, ancak veziküllerle ilişkili olanların oranı değişken olabilir.

p en az iki parametreyle ilişkili olmalı: vezikülün salınma bölgesine bağlanma (vezikül mobilizasyonu) ve AP’nin bağlanmış vezikülü boşaltma olasılıkları. P’nin AP sırasında presinaptik bölgeye Ca⁺⁺ girişine bağlı olduğu düşünülüyor.

a = kuantal büyüklük: Postsinaptik membranın tek bir kuantaya yanıtı. Postsinaptik membranın özelliklerine (“input” direnci ve kapasitans) ve transmitere duyarlılığına bağlı. Bu büyüklük hakkında bilgi edinmek için, belli bir miktar transmiter uygulanarak postsinaptik yanıt ölçülür.

Del Castillo ve Katz’ın kuantal salınma için kanıtları:

· UPP amplitüdü düşük ACh düzeylerinde, adım adım yükselir

· Her adımdaki artış, birim (ünit) potansiyelin katları

· Birim potansiyelin amplitüdü spontan MUPP’e eşit

Eksternal Ca⁺⁺ konsantrasyonu normalse, presinaptik sonlanmadaki bir AP, her biri 0.5 mV genliğinde olan yaklaşık 150 kuanta salıyor à büyük bir UPP. AP yoksa, spontan salınma çok az à sn’de bir kuantum. AP ile presinaptik sonlanmaya Ca⁺⁺ girince, kuantal salınma 100 000 kat artıyor à 1-2 msn içinde 150 kuantanın senkron salınması.

TRANSMİTTER DEPOLANMASI VE SALINMASI SİNAPTİK VEZİKÜLLERDE OLUR

Hücrenin hangi morfolojik özellikleri kuantum’ları açıklar?

EM’da presinaptik terminalde küçük veziküller görülüyor. Del Castillo ve Katz bunların her birinin bir kuanta transmiter depolayabileceğini düşünüyor (birkaç bin molekül). Vezikül membranla kaynaşınca (fuse) içini sinaptik aralığa boşaltıyor.

Aktif bölgeler, sinir-kas kavşağında presinaptik bölgede, içte elektron-dens görünümde. Kurbağada bir kavşakta herbirinde 10⁶ vezikül olan 300 aktif bölge var. Vezikül çapı yaklaşık 50 nm, şeffaf, oval veya küresel.

Fig. 11-1

Nöropeptidler ve nöroendokrin hücrelerden salınan ileticiler daha büyük ve yoğun veziküllerde. Bu veziküller aktif bölgelerde değil ve her yerden salınabilir (gövde dahil). Bu transmitterler daha yavaş sinaptik süreçlerde modülatör.

Kuantal salınmanın görülmediği tek yer: retina!

SSS’deki sinapsların çoğunda her AP 1-10 kuanta salınmasına yol açıyor. Bu sinir kas kavşağındaki 150’ye oranla çok az. Kas lifindeki bir sonlanma çok büyük (2000-6000 mm²)ve 300 kadar aktif bölgesi var. Oysa arka kök gangliyonundaki bir eksitatör afferent, motor nöronda her biri 2 mm² olan yaklaşık 4 sinaps yapıyor ve her sinapsta bir tek aktif bölge var à kuantal salınma hep veya hiç kuralına uygun. Salınma olasılığı, AP sırasında giren Ca⁺⁺’a bağlı.

Nöronlar arası tüm kimyasal haberleşme veziküler depolanma ve salınmaya bağlı değil! Membrandan geçebilen maddeler difüzyon ile yayılıp iletiyi sağlıyor: prostaglandinler, araşidonik asid metabolitleri, CO ve NO. Bu maddeler kimyasal iletici veya retrograd haberci gibi davranabiliyor. Bazı maddeler, intrasellüler konsantrasyonları yeterli düzeye çıkarsa taşıyıcı proteinlere bağlanıp sinir sonlanmalarıdan çıkartılabiliyor. Bazı retinal glia hücrelerinde normalde GABA ve glutamatı geri alan transporterler ters çalışıp transmitterleri ekstrasellüler aralığa salabiliyor. Bazı maddeler de sızarak sinaptik aralığa geçebiliyor. Örneğin presinaptik sonlanmada nöromüsküler kavşağa geçen ACh’in %90’ının sızdığı tesbit edilmiş, ancak bu miktarın tümü etkili değil, çünkü karşılarında reseptörler olmayabiliyor ve etkinlik çok düşük.

SİNAPTİK VEZİKÜLLER TRANSMİTTERLERİNİ EKZOSİTOZ İLE SALARLAR

Başlarda tek bir vezikülün ekzositozunun bir kuanta saldığını kanıtlamak kolay olmadı, çünkü tam eksositoz sırasında bir vezikülü yakalamak çok zor. Kurbağa sinir-kas kavşağından ince bir kesit total sinaptik membranın sadece 1/4000’ünü gösteriyor ve bir tek vezikülün ekzositik açıklığı EM’de kullanılan ultraince bir kesit kadar (50-100 nm). Bu engel 1970’lerden itibaren kullanılan “freeze-fracture” yöntemi ile aşılıyor.

Box 14-2: “FREEZE-FRACTURE” YÖNTEMİ

Sinaptik membranın detayları görüntülenebiliyor. Doku dondurularak vakum altında kırılıyor ve platin ve karbon ile kaplanıyor. Donmuş membranlar en zayıf noktalarından kırılma eğiliminde (iki moleküler lipid tabakası arasında). Bu durumda membranın iki komplementer yüzü açığa çıkıyor. İçe bakan yüz protoplazmik (P) ve dışa bakan yüz ekstrasellüler (E) yüz olarak isimlendiriliyor (Fig 14-7A). Bu yöntemle presinaptik membran alanı ortaya çıkıyor (Fig. 14-7B). Aktif bölgelerde membran deforme oluyor ve vezikülerin bağlı olduğu bu bölgeler rahatça görülüyor. “Freeze-fracture” EM yönteminin avantajı, aktif bölgenin geleneksel EM ile elde edilmiş bir ince kesit ile karşılaştırıldığında çok açık olarak anlaşılır.

Fig. 14-8

Bu yöntemi kullanarak Thomas Reese ve John Heuser 3 önemli gözlem yaptılar:

1. Her iki kenarda da presinaptik yoğunluk bölgesinde bir veya iki sıra çok büyük intramembranöz partikül sıralanmış durumda (Fig. 14-8A). Bu partiküllerin fonksiyonu bilinmemekle birlikte voltaj kapılı Ca⁺⁺ olabileceği düşünülüyor Yoğunlukları (mm²’ye 1500 kadar) transmitter salınmasından sorumlu olan Ca⁺⁺ kanallarına yakın. Bu partiküllerin salınma bölgesine yakınlıkları da Ca⁺⁺ akımının başlaması ile salınma arasında geçen çok kısa zaman ile uyumlu.

2. Sinaptik aktivite sırasında bu intramembranöz partiküllerde deformasyonlar oluşuyor (Fig. 14-8B). Bu deformasyonlar ekzositoz sırasında hücre membranının invajinasyonları olabilir.

3. Bu deformasyonlar transmitter salındıktan sonra gözlenmiyor; sadece transmitter salınması sırasında deformasyonlar oluşuyor.

Bu vezikülleri tam ekzositoz sırasında yakalamak için Heuser ve Reese presinaptik sinir uyarıldıktan hemen sonra belli aralıklarla sıvı helyum ile hızlı-dondurdular, ve ayrıca 4-aminopiridin ile voltaj kapılı K⁺ kanallarını bloke ettiler ki aksiyon potansiyelinin süresi uzasın ve salınan transmitter kuantası sayısı artsın. Bu teknikle ekzositoz sırasında sinaptik veziküllerin çok net görüntüleri elde edildi.

· Membranla kaynaşan veziküller omega-şeklinde (W) görünüyordu.

· 4-aminopiridin konsantrasyonunun değiştirilmesi salınan transmitter miktarını da değiştirdi.

· W-şeklinde yapıların sayısı postsinaptik yanıt ile doğrudan ilişkili idi

Bu morfolojik çalışmalar transmitterin sinaptik veziküllerden ekzositoz ile salındığını kanıtlıyor!

Ekzositoz sırasında veziküllerin füzyonu plazma membranının yüzey alanını arttırıyor. Bazı hücrelerde (adrenal kromafin hücr.-ACh, sıçan peritonunda mast hücreleri-histamin) bu artış, kapasitansta artış şeklinde elektriksel olarak da kanıtlanmış. Hızlı sinapslarda da Ca⁺⁺ artışına paralel kapasitans artışı gözlenmiş.

Fig 14-9

EKZOSİTOZ BİR KAYNAŞMA GÖZENEĞİNİN (“FUSION PORE”) OLUŞMASINI GEREKTİRİR

Halen sinaptik vezikül membranı ile hücre membranının kaynaşmasının nasıl olduğu ve bu süreçte Ca⁺⁺’un rolü araştırılmaya devam ediliyor. Morfolojik çalışmalara göre, ekzositozun geçici bir kaynaşma gözeneği oluşmasına bağlı olduğunu biliyoruz. Elekrofizyolojik kayıtlar (mast hüc.), tam ekzositozdan önce kapasitans artışı olduğunu ortaya koyuyor. Kaynaşma gözeneği tek bir kanalda geçirgenliğin 200 pS (“gap junction” gibi) olduğunu ortaya koyuyor. Ekzositoz sırasında gözenek genişliyor (1nm’den 50nm’ye) ve kondüktans çok aşırı yükseliyor. Bazı durumlarda tam füzyondan önce gözenek birkaç kez açılıp kapanıyor.

Fig 14-10

Transmitter salınması çok hızlı olduğuna göre, kaynaşma msn’nin küçük bir bölümünde gerçekleşmeli; vezikül kaynaşmadan önce uygun yere (“gap junction” gibi) yerleşmeli. Ca⁺⁺ sadece mevcut kanalı açıp genişletmeli ki transmitter salınsın.

Voltametri ile elektrokimyasal olarak amin içeren transmitterler (ör., serotonin) ekstrasellüler bir karbon lifli elektrod ile tayin edilebilir. Elektorda uygulanan yüksek voltaj salınan transmitteri okside eder; bu reaksiyon sonucu serbestleşen elektronlar salınan trasmitter miktarı ile orantılı bir elektrik akımı oluşturur. Aksşyon potansiyeline yanıt olarak büyük (transient) akımlar oluşur-tek bir yoğun vezikülün ekzositozu ile uyumlu. Bu büyük akımlardan önce genellikle küçük ve daha uzun süren sinyaller alınır-yavaş salınma. Bu akımların tam ekzositozdan önce transmitterin sızmasını yansıtıyor olduğu düşünülmektedir. Belki çoğu kez tam füzyon olmadan da transmitter salınmaktadır.

Fig 14-11

SİNAPTİK VEZİKÜLLER GERİ KAZANILIR (“RECYCLE”)

Eğer kaynaşmayı kompanse eden bir mekanizma olmasaydı, hücrelerin hacmi giderek büyür ve vezikül sayısı da azalırdı. Veziküllerin geri alınıp tekrar vezikül yapımında kullanılmasıyla bu önlenir.

Her ne kadar bir sinir sonlanmasındaki vezikül sayısı salınma sırasında geçici olarak azalıyor ise de, vezikül, sisterna, ve plazma membranlarının toplamı sabittir. Geri kazanma işleminin tüm detayları bilinmemekle birlikte, vezikülün “clathrin” ve bir protein olan “dynamin”kaplanması söz konusudur; bu epitelyal hücrelerde de böyledir.

Fig 14-12

Buna göre, sinaptik veziküllerin ekzositozdan sonra endozitozla alınıp endozom’a kazandırılması söz konusudur. Endositoz ve yeniden kazanma işleminin tamamlanması 30-60sn sürer. Kapasitans ölçümleri geri kazanmanın daha da hızlı olabileceğini göstermektedir. Uyaran şiddeti arttıkça “recovery” uzar. En hızlı şekil, ekzositoz tamamlanmadan kaynaşma gözeneğinin tekrar kapanmasıdır (öp ve kaç)

BİR TRANSMİTTERİN VEZİKÜLER SALINMASINDA ÇEŞİTLİ PROTEİNLER ROL ALIRLAR

Veziküllerin sinapslara yakın bir bölgede toplanıp aktif bölgelere bağlanmasını, Ca⁺⁺’a yanıt olarak membran ile kaynaşmasını ve sonra da tekrar geriye alınmasını sağlayan moleküler mekanizma nasıl çalışmaktadır?

Bu süreç ile ilgili olarak şu tür proteinlerin bulunması olasıdır:

1) Vezikülleri tutup yanlışlıkla mobilize olmalarını önleyen,

2) Serbest vezikülleri aktif bölgeye yönlendiren

3) Yönlendirilmiş vezikülleri aktif bölgeye bağlayan ve füzyonu hazırlayan

4) Füzyon ve ekzositozun olmasına olanak sağlayan

5) Plazma membranı ile kaynaşmış olan vezikül membranını endositoz ile geriye kazanan

Fig 14-13

Veziküllerin tutulması ve mobilizasyonu ile ilgili proteinler:

Aktif bölge dışındaki veziküller transmitter yedek deposu gibidir. Bular sitoplazmada serbestçe dolaşmazlar, sinapsinler ile hücre iskeletindeki filamentlere bağlanırlar. Sinapsinler 4 çeşittir: Ia, Ib, IIa ve IIb. Bunların içinden en çok Ia ve Ib üzerinde çalışılmıştır. Bunlar hem cAMP hem de Ca⁺⁺/kalmodulin kinaz için substrattırlar. Sinapsin I’in, fosforile olmadığı zaman vezikülleri aktin filamentlerine veya hücre iskeletinin diğer kısımlarına bağlayarak immobilize ettiği düşünülmektedir. Sinir ucun depolarize olup içeri Ca⁺⁺ girince, sinapsin I fosforile olur ve veziküller serbest kalarak aktif bölgeye doğru ilerlerler.

Fig 14-14

Sinaptik veziküllerin aktif bölgeye bağlanmalarında Rab3A ve Rab3C proteinlerinin rolü olduğu düşünülmektedir. Bunlar, ras proto-onkojen ailesi ile bağlantılı küçük proteinlerdir; GTP bağlayarak GDP ve inorganik fosfata hidrolize ederler.

Fig 14-14B

Rab proteinleri sinaptik veziküllere hidrofobik bir karbon grubu ile kovalan bağlanırlar. Rab’a bağlı GTP’nin hidrolizi (GDP oluşuyor) veziküllerin bağlanma için doğru yönlendirilmesinde önemli gibi görünmektedir. Ekzositoz sırasında Rab proteinleri sinaptik veziküllerden ayrılıp sitoplazmaya geçerler.

Vezikül hedef bölgeye gelip bağlandıktan sonra karmaşık bir dizi olay başlar ve vezikül membranındaki proteinler ile presinaptik membrandaki proteinler arasında etkileşimler olur. Bu sürecin ekzositoz için gerekli olduğu ve bu olayın sadece nöronlarda değil, tüm hücrelerde görüldüğü düşünülmektedir.

Salınacak olan tüm proteinlerin ribozomlarda yapıldığını ve endoplazmik retikulum lümeninden geçirildiğini görmüştük. ER’u terkeden veziküller Golgiye gidip kaynaşırlar. Golgide proteinler modifiye edilirler. Diğer veziküller, salınacak olan protein tamamen modifiye edilip olgunlaştırılıncaya kadar, proteini Golginin cis ve trans bölümleri arasında taşırlar. Daha sonra olgunlaşmış olan protein Golgi’den kopan veziküllerin içinde ayrılarak hücre yüzeyine doğru gider ve ekzositoz ile salınır. Bu tür salınma “konstitütif”tir (Ca⁺⁺’dan bağımsız ve sürekli). “Regüle edilmiş” (düzenlenmiş) salınma ise sinapslarda görülür ve Ca⁺⁺’un presinaptik terminale girmesiyle tetiklenir.

Membran veziküllerinin nasıl bağlanıp ekzositoza hazırlandığı konusunda ok önemli bir hipotez James Rothman, Richard Scheller ve Reinhard Jahn tarafından ortaya atılmıştır. Bu teoriye gre, vezikül membranındaki özgül integral proteinler (vezikül SNARES, veya v-SNARES) hedef membranda özgül reseptörlerine bağlanırlar (target membrane-SNARES, veya t-SNARES). Beyinde iki t-SNARE tanımlanmıştır: sintaksin ve SNAP-25. Sintaksin sinir terminalinde integral bir membran proteini, SNAP-25 ise 25 kD ağırlığında bir periferik proteindir. Presinaptik vezikül membranında ise VAMP (sinaptobrevin) v-SNARE olarak tanımlanmıştır.

Fig 14-15

SNARE proteinlerinin sinaptik iletideki önemi her üç proteinin de çeşitli klostridial nörotoksinlerin hedefi olmasıyla da anlaşılabilir. Bu toksinlerin hepsi sinaptik iletiyi inhibe ederler. Bu tür toksinlerden biri olan tetanus toksini (bir çinko endoproteaz’dır), VAMP’ı seçici olarak parçalar. Diğer 3 çinko proteaz (botulinum toksinleri A, B, C), seçici olarak, sırasıyla, SNAP-25, VAMP ve sintaksin’i parçalar. VAMP’ın bir diğer özelliği de viral füzyon peptidine benzemesidir.

Saflaştırılşmış proteinlerin lipid veziküllerde rekonstrüksiyonu ile gerçekleştirilen çalışmalar, VAMP, sintaksin ve SNAP-25’in membran füzyonundan sorumlu en küçük fonksiyonel üniteyi oluşturduğunu ortaya koymaktadır. Bu proteinlerin membran kaynaşmasını nasıl sağladıklarına ilişkin detaylı yapısal modeller önerilmektedir

Fig 14-15B

VAMP, sintaksin ve SNAP-25’in terner kompleksi, bu molekülleri olağanüstü stabil yapmktadır. Etkin şekilde vezikül geri dönüşümünün sağlanması için, bu kompleksin bozulması gerekmektedir. Bunu çözünmüş durumda (solubl) iki sitoplazmik proteinin bağlanması sağlamaktadır: n-etilamaleimid duyarlı füzyon (N-ethylmaleimide sensitive fusion=NSF) proteini ve solubl NSF bağlantı proteini (SNAP à bu protein SNAP-25 ile alakalı değildir, isim benzerliği rastlantısaldır). V-SNARE’lar ve tSNARE’lar SNAP’ın reseptörü gibi davranırlar (Zaten bu nedenle isimleri de SNAP Reseptörü’dür). Bu da sonra NSF bağlar. NSF bir ATPaz’dır, ATP’nin hidrolizinden sağladığı enerjiyi SNARE topluluğunu dağıtmak için kullanır.

Sinaptik vezikülde bulunan ve ekzositozda rolü olduğu düşünülen önemli bir diğer protein sinaptotagmin (p65)’dir. Sinaptotagminin protein kinaz C’nin regülatör bölgesi ile homolog olan iki C2 “domain”i vardır. Bu bölgeler fosfolipidlere kalsiyuma bağımlı şekilde bağlanırlar. Bu özellik, sinaptotagmin’in Ca⁺⁺ girişini takiben presinaptik fosfolipid tabakaya yerleşebileceğini ve böylece ekzositoz için adeta bir Ca⁺⁺ sensörü gibi davranabileceğini düşündürmektedir. Sinaptotagmin ayrıca bir v-SNARE gib de davranıyor olabilir, çünkü sintaksin ve bir SNAP izoformunu bağlayabilmektedir.

Sinaptotagmini bulunmayan bazı mutant hayvanlarda bu proteinin rolü araştırılmıştır. Bu deneylere göre, sinaptotagminin iki olası rolü üzerinde durulmaktadır.

1) Siaptotagmin füzyon kıskacı gibi davranmakta, veya Ca⁺⁺ yokken salınmayı engelleyen bir düzenleyici olarak görev yapmaktadır. Buna göre, Ca⁺⁺ girişi kıskacı açmakta ve süratle salınma gerçekleşmektedir. Bu oldukça cazip bir hipotezdir, çünkü sinaptik vezikül füzyonundan sorumlu mekanizma da (SNAP-SNARE kompleksi) dış kalsiyumdan bağımsız olarak konstitütif salınmada rol almaktadır. Bu modelin dayanağı Drozofila ve nematod çalışmalarıdır: sinaptotagmin geni olmayan mutant hayvanlarda sinaptik ileti bozulmakta ve presinaptik AP’e yanıt verilememektedir. Ayrıca drozofilada spontan MUPP amplitüdü de yükselmektedir ki, bu da sinaptotagmin’in inhibitör rol oynadığını düşündürür.

2) Sinaptotagmin salınmada pozitif düzenleyici rol oynamakta ve vezikül füzyonunu aktif olarak desteklemektedir. Bu görüşün dayanağı, sinaptotagmin’i olmayan mutant farelerde hızlı sinaptik ileti bloke olduğu halde spontan salınmada herhangi bir değişiklik olmamasıdır. Memelilerde sinaptotagmin’in birkaç izoformu olduğu halde omurgasızlarda sadece bir izoform vardır; memelilerde olasılıkla farklı formların farklı fonksiyonları bulunmaktadır. à Bir form düzenlenene hızlı salınmada sorumlu olurken, diğer bir form konstitütif salınmada rol alabilir.

Sinaptotagminin ayrıca endositozda da rolü olabilir. Aktif bölge dışında kalan fazlalık membranlar “clathrin” ile kaplanan bir çukur oluşturur. Membrana clathrin bağlanması bazı adaptör proteinler ile desteklenir. Sinaptotagmin clathrin için adaptör protein olan AP-2’nin reseptörü olarak davranır. Clathrin çukur etrafında bir tabaka oluşturur ve bu çukur bir kaplı vezikül oluşturarak membrandan ayrılır. Vezikülün membrandan kopması “dynamin” adı verilen sitoplazmik bir GTPaz ile sağlanır. Dynamin, endositoz sırasında vezikülün “boynu” etrafında kıskaç gibi bir helikal halka oluşturur. Dynamin’i defektif olan mutant drozofilada vezikül “recycling” yapılamadığı için sinaptik ieti buzulur.

SALINAN TRANSMİTTER MİKTARI, AKSİYON POTANSİYELİ SIRASINDA İÇE GİREN KALSİYUM MİKTARINI DÜZENLEYEREK MODÜLE EDİLEBİLİR

Kimyasal sinapsların etkinliği kısa ve uzun süreli olarak düzenlenebilir. Bu sinaptik plastisite, iki tür süreçle kontrol edilebilir:

1) nöronon içinde oluşan ve istirahat potansiyeli ve aksiyon potansiyellerinin ateşleme seviyesini değiştiren süreçler

2) diğer nöronlardan gelen sinaptik “input” gibi ekstrinsik faktörler

Uzun süreli değişiklikler gelişim ve bellek süreçleri ile bağlantılıdır. Bu konular ileride işlenecektir. Burada gerek presinaptik terminalde, gerek ekstrinsik faktörlerle oluşturulan kısa süreli değişiklikleri tartışacağız.

İntrinsik hücresel mekanizmalar serbest kalsiyum düzeylerini düzenlerler

Transmitter salınması intrasellüler Ca⁺⁺ düzeylerine büyük ölçüde bağımlılık gösterir. Bazı membranlarda presinaptik sonlanmaya sürekli spontan Ca⁺⁺ girişi vardır. Bu giriş, hemen hiç inaktive olmayan L-tipi Ca⁺⁺ kanallarındandır. Bu giriş, depolarizasyon ile artar, hiperpolarizasyon ile azalır. Bu durumda, membran depolarizasyonundaki hafif bir artış, bazal Ca⁺⁺ girişini ve bunu takiben AP’inde salınan transmitter miktarını artırabilir. Aksine hiperpolarizasyonda da azalma olacaktır.

Fig 14-16

Terminale giren Ca⁺⁺ miktarı üzerinden istirahat membran potansiyelindeki küçük değişikliklerle, bir nöronun sinaps etkiliğinin düzenlenmesi mümkündür. Bu tür değişiklikler presinaptik iyon kanallarını düzenleyen akso-aksonik sinapslarla diğer nöronlar ile de oluşturulabilir. Deneysel olarak, akım uygulanması da benzer sonuçlar verir.

Sinaptik etkinlik, çoğu nöronda yoğun aktivite ile değiştirilebilir. Bu hücrelerde ardarda gelen APlerinin (train) ardından bir süre için AP’leri daha büyük postsinaptik potansiyeller oluştururlar. Presinaptik nöronun yüksek frekanslı uyarılması (sn’de 500-1000 AP) tetanik stimülasyon adını alır. Tetanik stimülasyon sırasında potsinaptik potansiyel amplitüdünün yükselmesi potensiasyon, tetanik stimülasyondan sonra bir süre daha devam eden genlik artışı ise posttetanik potensiasyon adını alır. Bu kuvvetlenme genellikle birkaç dakika sürer, fakat bir saat hatta daha fazla sürdüğü de görülmektedir.

Fig 14-17

Posttetanik potensiasyonda, presinaptik sonlanmadaki çeşitli geçici Ca⁺⁺ tamponlama sistemlerinin (özellikle düz endoplazmik retikulum ve mitokonri) satürasyonunun etkili olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle Ca⁺⁺ düzeylerinde geçici bir fazlalık olmakta (rezidüel Ca⁺⁺), ve sinaptik ileti bir süre için kuvvetlenmektedir. Ca⁺⁺’a bağlımlı enzimatik yolakların kuvvetlenmesi de örneğin, sinapsinlerin fosforilasyonu ile, veziküllerin mobilizasyonunu destekleyebilir. Sinapsinlerin fosforilasyonu sinaptik veziküllerin hücre iskeletinden kurtulmasını sağlayacak ve veziküller mobilize olarak salınma bölgelerine gelip bağlanabileceklerdir. à AP daha fazla transmitter salınmasına yol açacaktır.

Bu hücresel bellek için basit bir mekanizma olabilir. (Daha uzun olanı LTP!)

Presinaptik terminallerdeki akso-aksonik sinapslar intrasellüler serbest Ca⁺⁺ düzeylerini düzenlerler

Akson terminallerinde de sinapslar vardır ve bunlar özellikle aksonların tek tek sonlanmalarını kontrol ederler (aksosomatik olanlar nöronda AP oluşmasını!). Akso-aksonik sinapslar presinaptik terminale giren Ca⁺⁺’u düzenleyebilirler.

Bir nöron bir başka nöronun gövdesini veya dendritlerini hiperpolarize edince, postsinaptik hücrenin ateşleme olasılığı azalır: postsinaptik inhibisyon. Oysa, bir nöron başka bir nöronun akson terminaline sinaps yaparsa, bu ikinci nöronda üçüncü bir nörona salınacak olan transmitter miktarını azaltabilir: presinaptik inhibisyon. Benzer şekilde akso-aksonik sinapslar postsinaptik hücreden salınacak olan transmitter miktarını arttırabilirler: presinaptik fasilitasyon. Nedeni tam bilinmemekle birlikte, bu tür etkiler daha çok duyu yollarında görülmektedir.

Fig. 14-8

Presinaptik inhibisyon ve fasilitasyon en iyi omurgasızlarda, mekanoreseptör nöronlarda araştırılmış ve 3 tür presinaptik inhibisyon saptanmış:

1) Metabotropik reseptörler aktive olup aynı anda Ca⁺⁺ kanallarının kapanıp voltaj kapılı K⁺ kanallarının açılmasına yol açıyorlar. Bu iki etki de Ca⁺⁺ girişini azaltıyor ve repolarizasyonu kuvvetlendiriyor.

2) İyonotropik, GABA-kapılı Cl^- kanalları aktive oluyor, Cl^- geçirgenliği artıyor ve presinaptik sonlanmada AP amplitüdü düşüyor (kısa devre gibi). Bunun sonucunda, AP daha az sayıda Ca⁺⁺ kanalını açıyor ve depolarizasyon daha az oluyor.

3) Yine metabotropik reseptörler arasılığıyla, fakat Ca⁺⁺ girişinden bağımsız bir mekanizma ile transmitter salınımı baskılanıyor. Bunun salınma mekanizmasında Ca⁺⁺‘a bağımlı adımlarda Ca⁺⁺‘a duyarlılığı azaltarak olduğu düşünülmekte.

Bunun aksine, presinaptik fasilitasyon Ca⁺⁺ girişinde artışa dayalı. Bazı yumuşakçalarda serotonin cAMP bağımlı protein kinazlar üzerinden fosforilasyon ile K⁺ kanallarını kapatıyor, AP genişliyor ve Ca⁺⁺ girişi daha uzun sürüyor. Ek olarak, cAMP bağımlı protein kinazlar doğrudan ekzositoz üzerine de etkili olarak salınmayı Ca⁺⁺ girişinden bağımsız olarak da ayrıca arttırıyorlar. Diğer ligand kapılı presinaptik kanalların aktivasyonunda (örneğin nikotinik ACh R veya kainat tipi glutamat R) transmitter salınmasında artış olasılıkla presinaptik terminali depolarize edip Ca⁺⁺ girişini arttırarak sağlanıyor.

Demek ki, presinaptik terminalde Ca⁺⁺ düzeyleri çok önemli. Kısa süreli etkileri bildiğimiz halde uzun süreli etkileri daha yeni yeni anlamaya başlıyoruz.